大分子and小分子蛋白跑wb的综合优化方案🧫

主包做170kd和10kd的蛋白，分享下经验叭～ （图中条带一抗来源均为Abmart） 1、样品制备： 🌟大分子： 用温和裂解液，例如ripa（中）、coip裂解液； 很多大分子是膜蛋白，可做温度梯度进行变性，选择合适温度 我做的大分子变性条件：70度，10分钟 🌟小分子： 可用强裂解液，例如SDS裂解液、ripa（强） 大部分变性条件：100度，5分钟 ➡️裂解液越温和溶解性越差，根据待测靶蛋白选合适的 ➡️保证10ul体系有20～30ug蛋白 2、凝胶体系（图2） 特别大的大分子可选择Tris-Acetate凝胶试剂盒，会比普通的效果好些，200kd左右的用普通配胶试剂即可 大分子：6-7.5%胶 小分子：12-15%胶 3、跑胶（图3图4） 🌟大分子： 把上面条带尽可能跑开，跑胶时间延长，低电压跑（100v），跑胶时间长可在冰水浴中进行，把下面的loading带跑出去，可选择略大分子内参：例如Hsp90，就能一起转膜 🌟小分子： 把下面的条带跑开即可停止，电泳时间缩短，电压可为130v，一般跑到胶的2/3处即可，不要跑到最下面，可选内参：GAPDH，actin等… 4、转膜（图5） 大分子：0.45um pvdf膜 (200kd以内也可用0.22um的，亲测没影响） 小分子：0.22um pvdf膜 转膜条件： 大分子200kd： 恒压90v 或 恒流300mA 2.5h 小分子10～20kd： 恒压90v或 恒流300mA 20～30min，如果有30～50kd的内参一起转，可转45min 采用冰水混合物，湿转法（尤其大分子），效果更好，个人感觉大分子转膜：采用传统转膜液比快转好很多，配方在图7，可用乙醇代替甲醇 比较需要注意的就是这几方面❗️ 从封闭到一二抗孵育没啥差别，一抗的选择也很重要～ Abmart家的一抗是本人一直在用的！好几个指标都用过，效果都挺理想的嘿嘿😈 例如…细胞自噬Parkin，凋亡Bax，bcl2 ，焦亡GSDMD，炎症小体nlrp3等…图6指标为Bax 很多都有试用，需要的宝宝可以找他们哦